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脂質體載體用於直接體內基因轉染實驗

脂質體載體用於直接體內基因轉染實驗

 

用於組織培養物中的細胞的脂質體轉染的許多陽離子脂質體都能夠購買得到。成分優化高度依賴細胞類型,而與在進行體內轉染相對應組織時,典型的優化的成分不相關。所以,對於體外的轉染,建議讀者在說明書的指導下測試不同的商業脂質體。

1.用CH3Cl3將 30.0ml 的透紫外燈玻璃管漂洗 3 次。

2.混勻用於準備脂質體的在透紫外燈玻璃管中的適當的脂質。

1)對於 DC-Chol/DOPE 的脂質體(摩爾比 3:2): 加入1.07ml DC-Chol 儲存液 和 0.1 ml DOPE 儲存液,來回漩渦振蕩混勻。

2)對於DOTAP/cholesterol 脂質體(摩爾比為 1:1): 加入 1.0ml DOTAP 儲存液和 0.55 ml 膽固醇儲存液,來回漩渦振蕩混勻。

3.用手旋轉管子,同時通過沿著管壁吹氮氣,蒸發CH3Cl3,形成薄的脂質薄膜。

4.在真空幹燥器中幹燥 2~3 h,使膜完全幹燥。為了避免在真空環境下脂質膜的丟失,用鋁箔在管口蓋住,並在鋁箔上麵用 26-G1/2 的針戳一些小洞。

5.加 2.Oml 5.2% 的葡萄糖溶液到膜上。

6.旋轉管子將脂質重懸直至差不多所有的脂質膜都重懸在溶液中。

脂質可能存留在管壁上,以白色固體沉澱出現。在水浴超聲破碎儀中處理幾次將幫助溶解脂質到溶液中

7.將懸液室溫放置 2~3 h 或者 4°C 過夜,讓脂質完全水合。用石蠟膜封住。在 65℃的水浴箱中加熱懸液 5~10min。

8.為了使脂質凝聚物彌散,將脂質溶液置於水浴超聲破碎儀中進行超聲處理直到所有的凝聚物都消失,然後放回水浴。

9.將兩個 1.0um 聚碳酸釀膜濾器放在擠壓機中,加熱擠壓機到 65°c,5 min。

10.通過將懸液通過擠壓其 10 次,擠出脂質分散物。擠壓後置水浴。

   懸液壓縮處理後,應該由不透明的混濁的溶液變成透明而混濁的懸液。

11.用 0.4um 和 0.1um 的聚碳酸酯膜濾紙,重複第 9~10 步,從而得到小的單層的脂質體,直至為 100~200nm。將脂質體儲存在 4°C(可至 12 個月)。

這些脂質體隨時可以用於與 DNA 混合用於基因轉染。

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